做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很困难的，1 个月做 100 个克隆那都是 小 case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较稀有的基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面远慕生物就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人！
1. 准备工作
俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推荐两个工具，一个是 oligo 软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是 DNAstar 软件，工具ji强大，一款全面的生物医学软件，用作 DNA 和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。
2. 设计引物
1) 注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来 结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1 质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！
其他需要注意：
*设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用 T 载体就当我没说）;
*酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算 TM 值的时候要减去这些不匹配的序列；
*注意 KOZAK 序列的问题，很多质粒没有提供 KOZAK 序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。
*擅用 Gene Overlap，比方说加个 flag 标签，his 标签，my 标签之类的，直接设计三引物 overlap 一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（两步法），尤其是对 GC 比高的序列，有时候引物不长 PCR 根本不出结果，注意如果 GC 比较高，这个时候 Gene Overlap 就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。
*没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。
3. PCR 扩增
如果没有现成的质?？晒┟盖校琍CR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可选择的 PCR 酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的 taq 酶都能满足需求。但如果遇到难 PCR 的高 GC 基因，可以换不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑 Clontech 的 2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化 PCR 产物， 去除一些非特异性条带。
4. 酶切
强烈推荐 NEB 的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用 NEB 的酶，切个七十二小时仍旧一切 OK，尤其现在 NEB 还推出了 HF 的内切酶，没有星活性而且统一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也还可以。
5. 连接
常用的是 NEB 的 T4 连接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反复冻融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分装，10uL/管，一次性使用。
载体总量：一般来说，载体浓度在 20-100ng/uL 较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从 50-100ng 就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用 10-15uL。
载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是 1:7，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例 1:10。
6. 转化
按照 SOP 做就行，话说实验室原来从 takara 买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol 免费索?。Ｒ⒁獾氖?LB 必须无菌而且没有抗生素。
7. 鉴定
想要快速鉴定，建议用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定讲究的，很多人做菌液 PCR 鉴定假阳性特多，为什么？因为你 PCR 引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR 方法鉴定是极其准确的，数百次菌液 PCR 经验。PCR 鉴定做起来也很简单， 拿个 2mL tube，装 0.5mL 加入相应抗生素的 LB，摇个三小时左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不错，效果一样。
8. 测序
拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；还要重点检查的地方就是“接头"的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。
