荧光蛋白的亮度与启动子、表达方式和连接原件等有关，不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，如UBC相对于EF1α、CAG、CMV等强启动子表达较弱。

融合或非融合表达与荧光强度也有很大关系，融合表达时荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱。非融合表达时一般选择连接肽作为连接原件，如2A肽或IRES将ORF分隔开；选择IRES，下游ORF的表达明显弱于上游，2A肽可以避免上下游ORF表达强弱不一致的问题，因此更为常用，如P2A和T2A不过2A肽切割后容易有残留氨基酸。

带荧光的慢病毒感染细胞后，荧光的强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞状态、细胞类型、观察时间等因素，荧光表达的强度与目的细胞感染病毒的颗粒数正相关，一般感染细胞后72h观察荧光强度最佳，而增殖较慢的细胞可以适当延长时间。

也可能会遇到过表达的慢病毒比对照的荧光要暗的情况，这主要是因为基因的插入，会影响位于下游的荧光蛋白表达，对照或干扰的病毒由于没有插入或插入序列非常短荧光不受影响，而插入基因后，尤其是较长片段和高GC片段，则会降低荧光强度。