1.因为WB的一抗识别的蛋白质的表位是顺序表位，不是空间表位，所以WB状态下的抗原-抗体识别，与非变性的生理条件下的抗原-抗体识别不同。

2.WB之前，先用分子筛纯化同时也是检测一下目的蛋白产物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表达了，而且在提取后稳定存在了。

3.非特异性的条带分子量偏大可能是SDS PAGE出的问题，胶的浓度不合适或者样品溶解度不够或者电泳时间不合适等，造成了目的条带的表观质量变大。

4.三个非特异性的分子量偏大条带之一可能是目的蛋白在SDS PAGE出的问题出了问题，另外两个带可能本来就是杂带了。可以回收后对三条带用质谱检测精确的分子量加以确定。

5.三个非特异性的分子量偏大条带至少应该有杂带，杂带出现而且与一抗相互作用，那么只能说杂带的顺序表位也能被一抗识别，必须更换专一性更高的抗体。

6.还有考虑镍柱亲和分离的问题，是不是获得了你的需要的目的蛋白质。